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2019/07/14

丙型肝炎實驗室檢測技術進展

丙型肝炎實驗室檢測技術進展
2009-06-28 08:42:08 作者:佚名 來源:本站整理 瀏覽次數:0
丙型肝炎病毒(HCV)是輸血後肝炎和散發性非甲非乙型肝炎的主要病原Ⅲ 。1989年9月在東京召開的國際非甲非乙型肝炎會議上正式命名此種病毒為丙型肝炎病毒(HCV),由HCV引起的肝炎稱之為丙型肝炎(HC)。
丙型肝炎病毒(HCV)是輸血後肝炎和散發性非甲非乙型肝炎的主要病原Ⅲ 。1989年9月在東京召開的國際非甲非乙型肝炎會議上正式命名此種病毒為丙型肝炎病毒(HCV),由HCV引起的肝炎稱之為丙型肝炎(HC)。
 
1 HCV基因的特點
 
HCV是一種新的病毒類型,屬於單股正鏈的RNA病毒,其基因組編碼多 與其他病毒序列之間整體同源性較小,然而幾組實驗結果表明,HCV是人類黃病毒。首先HCV 5末端區域與瘟病毒的對應區域有較多的同源性(45 ~49 ),而HCV多 的親水性同黃病毒多蛋白很相符,且三者的基因結構和功能也很相似。這與近來把它們分類為黃病毒中3個不同的屬相一致。HCV與瘟病毒、黃病毒的親緣進化關係,可能促進未來有關HCV感染的生物學研究,亦可能有助於一些重要問題
 
的解決,如:HCV非輸血傳播途徑中可能涉及的媒介、某種細胞作為病毒儲存庫的可能性、是否存在病毒基因在宿主基因的整合導致慢性化、是否存在通常的嗜肝外的不同細胞的新嗜性引起臨床表現的多樣化、以及是否存有抗體依賴性加強現象等。此外,黃病毒減毒活疫苗的成功,為HCV重組疫苗的開發提供了樂觀前景。
 
2 HCV株型的序列分析
 
自從1989年Choo報道HCV部分序列(731Obp)以來,許多研究者已完成了多個HCV全基因或基因片段分析。從已有的數據看,這些不同克隆的核 酸(nt)有很大差異,同源性從57 ~92 不等。不同型克隆間核酸同源性小於80 ,同型各株間甚至同一個HCV攜帶者分離出的基因克
 
隆之間也有一些差異。Ogata從同一患者血清分離到的1979年株與1990年株進行比較發現,在4 923個nt中就有123個不同。有人認為HCV核酸序列隨著時間推移而變化以逃避宿主免疫系統。1991年崗本公布了Et本HCV亞型分類,HCV各株之間包膜蛋白與序列有26 ~44 不同。因此分為HCJ 、HCJ 、HCJe和HCJ,4種株型。Et本HCJ最多,美國HCJ 最多。
 
3 HCV感染的實驗診斷
 
目前用于HCV感染的實驗診斷方法主要有兩種,檢測抗一HCV 和HCV RNA。
 
3.1 抗一HCV檢測
 
1989年5月,美國Chirob公司用分子克隆法分離到一個能表達NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1—1。又將3個與5-1—1有共同ORF的重疊克隆連接起來建立了另一個克隆C100 。C 100與超氧化物歧化 (SOD)基因融合在酵母中重組表達的多 即C oo一。。完整的C·oo一。多 的N端有154個SO D氨基酸,5個由EcoR I位點人工接頭表達的氨基酸和363個HCV C100。cDNA編碼的氨基酸;在其C端還有5個MS2的氨基酸。HCV C oo一。抗體檢測系統,是最早應用的檢測方法。世界各地關於HCV在各種人群中的感染率,基本上都是來自這種試劑盒的檢測。檢測結果證明,HCV是世界上幾乎所有輸血後非甲非乙型肝炎和部分散發性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由於Cloo只含363個氨基酸,而HCV基因組編碼的蛋白有長達3 010個氨基酸。因此C1oo一。抗原一抗體系統只代表整個HCV抗原抗體系統的-4'部分,所以敏感性不高,抗C100。一。出現也太晚,不適於早期診斷,且有些病人根本不出現。該方法使用的抗原含SOD融合蛋白,因此當人體存有抗一SOD時常常出現假陽性。但採用RIBA方法能排除因C 100。一。抗原中含SOD部而引起的假陽性反應,常被用作確認實驗。第一代的RIBA-1試劑,含有C1oo一。、5-1—1兩種抗原(包括SOD序列),同ELISA相比特異性明顯提高,避免了假陽性,但靈敏度都降低了。第二代RIBA-2試劑含有四種抗原。在C 100-3。、5-1-1基礎上又增加了兩個抗原。C(NSa區)和C2z一。(C區)使用多個抗原之後,不僅提高了檢測特異性,而且大大提高了靈敏度,對於ELISA方法檢出的可疑或弱陽性樣本,尤其適用RIBA方法做確認實驗。隨著HCV基因序列的闡明,人們發現C區基因編碼蛋白較E區和某些非結構區蛋白都保守。因此,用C區基因產物檢測HCV抗體顯得更加合理,於是相繼建立了一些新的檢測方法,試圖克服C100。抗原的某些缺陷,稱之為第二代抗一HCV試劑。第二代重組基因多 檢測抗一HCV的ELISA技術是在原包被抗原加入了核心抗原C2z一。、C o、C o。和第一代試劑 (C100—3)相比,第二代試劑具有檢出率高(可提高25 ~30%),而且抗體出現提早到16~60天。由於重組基因多 抗原中仍有SOD多 ,所以仍存在抗一SO D造成的假陽性,於是人們開始採用人工合成 段建立檢測抗一HCV的新試劑。用中國北方地區HCV全基因序列,根據文獻開發的預測蛋白理化性質及二級結構和抗原決定簇可能位點的序列軟體,完成了HCV全基因序列的親水性、親近性、移動性分析,已預測到HCV抗原決定簇的位點。先對研製的C區3個寡 (CPA、C e、CPzo)進行了抗原活性比較並初步應用於臨床,同時與日本基因工程C區表達多 C 進行比較。CP8+CP。e陽性率與C 的陽性率無明顯差異,符合率為87.6 。用所建立的雙PCR試驗,比較82例抗一CP與HCV RNA的檢測結果,符合率為87.5 。許多國家的經驗證明,對獻血員進行抗一HCV測定,可大大降低輸血後患丙肝的風險[20],降低丙型肝炎的發病率 ]。因此HCV檢測可成為早期感染的檢測指標[7 ]。
 
3.2 HCVRNA的檢測
 
聚合 鏈反應是目前分子生物學中最敏感的方法,樣品中只要有一個拷貝的HCV 序列就有可能被檢出。由於HCV在被感染者體內濃度很低,逆轉錄RNA PCR(RTPCR)才能檢測到血清中的HCV RNA。PCR技術有許多優點:(1)特異性強。抗一HCV陽性不能直接說明受檢者體內當時HCV是否存在,而PCR所檢的HCV RNA可作為有無傳染性的直接指標。(2)敏感性高。可發現抗一HCV陰性者HCV感染。(3)陽性出現早。可在ALT增高的同時檢出。黑猩猩感染HCV後第3天即可在血清中檢出HCV RNA。(4)應用較廣泛。可檢測組織和體液中RNA。但操作程式較複雜,技術要求嚴格,試驗成本高,所以只限於有條件的實驗室使用。1991年由北京醫科下學肝病研究所建立了一項直接檢測HCV PCR的雙重PCR法,亦可稱“一步法”。特點是微量(可從100~1血清中提到RNA)、簡便(不用低溫超速離心機等設備)、快速(從提取RNA逆轉錄可在4小時完成)、減少Rnase污染,1~2天內可發報告。由於PCR的諸多優點,只要不斷的改進方法,使之更趨簡便、快速,必將成為HCV感染診斷的重要手段。最近有研究結果表明,在原RT—PCT的基礎上再進行定量PCR,其方法是在樣品PCR反應混合液內加入。HdTTP摻入,液閃法測定。H摻入的CPM值以純化已知濃度的cDNAsfuw(
 
10pg/每管30UI),再計算待測血清中RNA的動態變化。初步研究結果發現,在治療前後血清中RNA的深度變化較大。2例病人用a一干擾素治療的病人中,雖然血清AI 轉為正常,但血清中的RNA含量變化不大。提示該方法對丙型肝炎的療效觀察有一定的參考價值。
 
目前各廠家出售的抗一HCV試劑盒,其間的試劑的靈敏度、特異性存在一定的差異 ,分別由重組基因多 人工合成多 組成,基因工程多 的優點是:(1)可包含多個抗原位點。(2)一旦克隆表達成功則產量高、價格低。(3)表達多 的穩定性好。(4)可將幾個片段重合使用,有較高的特異性和敏感性。(5)純化簡單,無其它蛋白干擾,可做抑制試驗。缺點是:(1)克隆表達技術要求較高,不易達到滿意結果。(2)表達產物純化困難,含有菌體等其它蛋白干擾。(3)每批產量間穩定性比間差異小。合成的EP27及其檢測結果,提示了它與第二代抗一HCV試劑的不同點 。
 
 
關鍵詞:丙型檢測技術肝炎
 
本篇文章來源於 檢驗在線 http://www.labbbs.com/  原文連結:http://66.163.168.225/babelfish/translate_url_content?.intl=tw&lp=zh_zt&trurl=http%3a%2f%2fwww.labbbs.com%2farticle%2fjishu%2f2OMDAwMDAwMDg2OQ.html

肝功能檢查

肝膽功能及病毒性肝炎檢測

肝膽胰脾
系統

肝臟膽道疾病

          及

肝炎診斷參考

1.GOT(AST)

2.GPT(ALT)

3.ALP(鹼性磷酸脢)

4.蛋白比值

5.總膽紅素 T-Bil

6.直接膽紅素 D-Bil

7.丙型麩胺醯轉移酶 r-GT

臨床相關檢測意義

1.覺得疲倦

2.病毒性肝炎追蹤

3.脂肪肝、酒精肝追蹤

4.藥物使用過量

5.自體免疫性肝炎

6.肝硬化、其他肝膽疾病

7.睡眠品質及睡眠時數異常

8.保健食品使用過量:如:紅麴

 

     1-7項

 肝膽功能

 基本檢測

      500

  預約檢測

 

 

1.甲型胎兒蛋白 AFP 慢性肝炎、肝癌參考指標  
2.A型肝炎表面抗原
HAV-IgM
是否感染A型肝炎或為帶原者  
3.A型肝炎表面抗體
HAV-IgG
是否有A型肝炎抗體  
4.B型肝炎表面抗原HBsAg 是否感染B型肝炎或為帶原者

   1-10項 

 肝膽胰脾

 全部檢測   

    4,000

 預約檢測
5.B型肝炎核心抗體
Anti-HBc
測定是否感染B型肝炎  
6.B型肝炎表面抗體
Anti-HBs
是否有B型肝炎抗體  
7.C型肝炎抗體 Anti-HCV 是否有C型肝炎抗體  
8.澱粉酶 Amylase 胰臟炎診斷參考  
9.醣鎖抗原 CA-199
10.脂解酵素 Lipase
胰臟及膽道癌症參考指標
胰脾發炎早期指標
 

HAV-IgG A型肝炎抗體 。 了解對於A型肝炎病毒是否具有保護能力。
年輕人很多都沒有抗體 沒有可以去打疫苗  500   ←預約

HAV-IgM 了解是否有感染到A型肝炎病毒,傳染途徑是經由不潔的食物與水源或是唾液經由口腔/糞便傳染  身體可能會有嘔吐或腹瀉之狀況,餐飲服務業須注意 500 ←預約

HBsAg 了解是否有感染到B型肝炎病毒   傳染途徑是病毒經由血液、體液經由皮膚或黏膜進入人體像是母子傳染其他如輸血、打針、血液透析、針灸、穿耳洞、刺青(紋身)、共用牙刷、共用刮鬍刀,都可能是B型肝炎的傳染途徑。250  ←預約

Anti-HBs 了解身體是否產生抗體對於B型肝炎病毒是否具有保護力,
小朋友或大朋友打完抗體後要記得追蹤  300 ←預約

HBeAg  了解體內B型肝炎病毒是否具有傳染性 500

Anti-HBc 了解是否感曾經感染過B型肝炎病毒 500

HBV-DNA-PCR 接觸1-2個月以上可縮短空窗期早期檢驗是否感染B型肝炎病毒並評估病毒量及用藥標準,
滿3個月提供B型肝炎抗原追蹤乙次服務  2,000

HBV基因分析 檢測常見六種亞型,亞型B之治療感受性較好,亞型C則較易形成慢性肝炎>肝硬化>肝癌 3,000

HBV DNA病毒抗藥性分析 評估貝樂克/肝安(適)能/惠力妥/喜必福等常見用藥是否呈現抗藥性 5,000

Anti-HCV 了解是否感染到C型肝炎病毒 500 ←預約

HCV-RTPCR 接觸1-2週以上可縮短空窗期早期檢驗是否感染到C型肝炎病毒,可了解病毒量及評估用藥標準
滿3-6個月提供C型肝炎抗體追蹤乙次服務 3,000

HCV基因分析 檢測6種基因亞型 若是亞型1b則較易形成肝硬化及誘發肝癌 4,000

Haptoglobin  肝球蛋白  運用於脂肪肝.急慢性肝炎.肝硬化及膽道阻塞患或脾腫大。500

Ammonia 氨   了解肝臟代謝蛋白質及解毒能力 與頭昏腦脹.肝腦昏迷有關。500

AFP 甲型胎兒蛋白 慢性肝炎及肝癌篩檢 500

AST 肝指數 評估肝臟代謝 100
ALT  肝指數 評估肝解毒能力 藥物肝 酒精肝 脂肪肝 病毒性肝炎 100
r-GT 酒精肝  100
T-Bilirubin 總量膽紅素 與睡眠及膽汁淤積有關 100
T-G 三酸肝油脂  間接評估脂肪肝程度  要空腹8小時才能測 150
腰圍女生<80公分  男生<90公分 間接評估脂肪肝程度,自己在家就能量

【肝穿刺及肝超音波則在醫生建議下執行操作】



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